В основе флуоресцентной микроскопии лежит использование флуорофоров – специальных веществ, которые за счет своей особой химической структуры способны поглощать энергию света, а затем испускать эту энергию в виде собственного яркого свечения – флуоресценции (вспомним ужасную светящуюся в темноте собаку в повести А. К. Дойля «Приключения Шерлока Холмса: Собака Баскервилей»). Однако каждый флуорофор тратит часть полученной энергии на её удержание и может испустить только менее энергоемкий свет, который находится в другой части спектра. Поскольку преобразование света в каждой молекуле идет по-разному, то ученым доступен широкий диапазон разноцветных флуорофоров для работы, сравнимый с радугой – от темно-фиолетового до ярко-красного.
Такие флуорофоры могут быть различными по своей химической природе. Самым знаменитым и широко используемым, пожалуй, является флуоресцентный белок, выделенный из медузы Aequorea victoria – Green fluorescence protein (GFP). Впоследствии были разработаны синтетические аналоги природных флуорофоров, например квантовые точки – крошечные кристаллы, которые меняют свой цвет только в зависимости от размера и формы. Однако жизнь флуорофоров хоть и яркая, но совсем недолгая. Каждая молекула может светить очень ограниченное время, которое редко превышает несколько десятков секунд. Затем флуорофор гаснет, и на месте прежде красивого свечения формируется черная дыра, в которой уже совсем ничего нельзя различить. Поэтому ученые постоянно борются за создание более долгоживущих и более стабильных флуорофоров.
Откуда же берется свет, который должен заставить наши флуорофоры светить, и как нам увидеть это свечение? Тут вступают в дело специализированные флюоресцентные микроскопы. Во-первых, такие микроскопы оснащены специальными источниками света, которые могут передать энергию флуорофорам и зажечь их. Раньше для этих целей широко использовали ртутные лампы. Но из-за их небезопасности в обращении (они весьма взрывоопасны) сегодня все больше производителей переходят на светодиодные лазеры, аналогичные тем, что есть в лазерных указках. Во-вторых, каждый флуоресцентный микроскоп оснащен светочувствительной матрицей. Такая матрица способна накапливать свет от флуорофоров и запоминать его положение в исследуемом объекте, а затем передавать эту информацию на компьютер, где уже сформируется итоговое изображение. Следует отметить, что матрица способна детектировать свет даже в невидимом для человеческого глаза диапазоне свечения, например в инфракрасном или ультрафиолетовом, что существенно увеличивает количество используемых флуорофоров. Немаловажным компонентом микроскопа, если планируется проведение работы с живым объектом, является и камера для жизнеобеспечения объекта – специальное оборудование для поддержания оптимальной температуры, pH, концентрации газов. А самые современные микроскопы включают в себя специализированные модули, которые позволяют автоматизировать работу и снимать целые фильмы о поведении клеток или развитии организмов.
Теперь у нас с вами есть прибор, с помощью которого можно следить за флуоресценцией, и сами источники флуоресценции. Но как же с их помощью разобраться с тем, что происходит в клетках, тканях или целом живом организме? Для этого используют технологии, которые помогают присоединить флуорофоры к различным клеточным компонентам. Самый распространённый подход – связывание флуорофоров с антителами или зондами (нуклеотидными последовательностями, комплементарными ДНК или РНК), которые впоследствии могут соединяться со специфическими мишенями в клетке и тем самым помечать их локализацию. Если для изучения используются антитела, являющиеся компонентами иммунной системы организмов, то такие методы получают название «иммунофлуоресцентные». Однако для проникновения антител и зондов в клетку чаще всего ее требуется зафиксировать и перевести в неживое состояние. Также из-за их большого размера невелика и глубина проникновения в ткань, приходится предварительно делать ультратонкие срезы ткани для окрашивания. Сегодня в регенеративной медицине флуоресцентные антитела и зонды широко используются для определения маркеров различных типов клеток, например с целью подробной характеристики выделенных из биоматериалов клеточных культур, диагностики патологических изменений в клетках или тканях, понимания, являются ли исследуемые клетки стволовыми или дифференцированными. Флуоресцентные метки незаменимы для установления локализации белков в клетке или наличия повреждений в ДНК. Изучая ткани, можно оценить изменение клеточного состава и состояние структурных компонентов, например кровеносных сосудов и нервных окончаний или компонентов внеклеточного матрикса, в эмбриогенезе, при физиологическом обновлении или восстановлении тканей после повреждений.
Микрофотографии разных клеток человека и экспериментальных животных, полученные с помощью иммуноцитохимического анализа
Но интерес учёных не ограничивается только фиксированным, замершим в одной временной точке материалом. Всегда гораздо интереснее исследовать какой-то процесс в динамике! И тут на помощь приходят трекеры – флуорофоры, которые могут светиться только в определённом компартменте живой клетки: ядре, митохондриях, лизосомах. Для ряда трекеров неоспоримым преимуществом является их способность к изменению цвета в зависимости от функционального состояния органеллы. Например, широко используемый флуорофор родамин-123 метит только активно работающие митохондрии. Но круг таких флуорофоров весьма ограничен, и век их всё ещё недолог.
Поэтому самым совершенным инструментом в руках учёных на сегодняшний день являются генетические конструкции, кодирующие флуоресцирующие белки, объединённые с нужным белком. С помощью таких конструкций можно научить клетки самостоятельно синтезировать любой интересующий белок вместе с флуорофором во время всей её жизни! Таким образом можно наблюдать практически за любым процессом, который происходит в клетке: как она делится и как она гибнет, как внутри неё передвигаются органеллы и секретируются вещества. Более того, используя такой подход, можно получить линию животных, например мышей, клетки которых также будут синтезировать флуоресцентный белок. Такой подход стал незаменимым инструментом в регенеративной медицине, ведь он позволяет изучать процессы регенерации in vivo. Именно с помощью генетически модифицированных клеток и животных становится возможным проследить вклад каждой отдельной клетки в формирование тканей. Одним из самых ярких примеров является технология Brainbow (от английского brain – «мозг», и rainbow – «радуга». С помощью этой технологии практически каждая клетка мозга получает способность испускать свой уникальный спектр флуоресценции, что позволяет учёным изучать взаимодействие даже самых крошечных частей нервных клеток – дендритов и аксонов – друг с другом в целом мозге.
А что же ждёт флуоресцентную микроскопию дальше? Сегодня учёные активно работают не только над разработкой новых методов, но и над внедрением подходов флуоресцентной микроскопии в область персонализированной медицины. Например, сейчас активно создаются инструменты выявления опухолевых образований с помощью флуорофоров. Это облегчает диагностику опухоли на ранних этапах и её более точное удаление из организма пациента.
Иллюстрация (обложка): Елена Рюмина
Фотографии: Анастасия Ефименко, Наталья Басалова, Роман Еремичев, Наталья Алексадрушкина.
