Развитие регенеративной биомедицины привело к тому, что исследователи для разных целей вводят в организм живые клетки. Их используют как инструмент для замещения и восстановления повреждённых тканей или как «умный контейнер» для направленной доставки препаратов, генетических конструкций или других молекул. При этом важно проследить, как распределяются и мигрируют введённые клетки, выжили ли они вообще и добрались ли до нужного места, выполнили ли свою задачу. Параллельно исследователи следят и за нежелательными эффектами: не появились ли опухоли или микротромбы или, может быть, введенные клетки погибли и вызвали сильный иммунный ответ? Как решить эти задачи?
Оценить клеточные препараты методами классической фармакологии нельзя. Можно использовать лабораторных животных, моделируя у них патологические состояния, затем выводить их из эксперимента в разные временные точки после введения клеток и анализировать образцы интересующих нас тканей. Однако современные принципы биоэтики требуют использовать минимально возможное количество животных. Сейчас при планировании исследований предпочтение отдаётся подходам, позволяющим анализировать в динамике судьбу введённых клеток и связанные с ними изменения в организме живых животных. На помощь учёным приходят методы прижизненной визуализации клеток in vivo. В арсенале исследователей есть несколько групп таких методов, которые в основном делятся на оптические и неоптические.
Оптическая микроскопия и светящиеся клетки
Самые широко используемые предполагают анализ изменений в организме экспериментальных животных с помощью наблюдения и регистрации оптических изображений. Уже давно применяется прижизненная оптическая микроскопия мелких прозрачных животных (рыбок Danio rerio, эмбрионов ранних стадий), однако и для более крупных животных, таких как мыши, гораздо чаще используемых для исследований, тоже разработаны методы прижизненной микроскопии. Они включают в себя микроскопические методы с использованием флуоресцентного или биолюминесцентного имиджинга клеток: проще говоря, исследователи или находят в самих клетках «светящиеся» элементы, или «подсвечивают» их с помощью специальных манипуляций, вводя в клетки метки для интересующих структур. Некоторые собственные молекулы клеток способны к флуоресценции (например, порфирины, некоторые аминокислоты, липиды и другие молекулы), поэтому учёные могут отслеживать их спектры, но различить при этом введённые клетки и клетки хозяина может быть затруднительно.
Гораздо чаще используют экзогенные (то есть введённые извне) флуоресцентные метки или наночастицы (например, диоксида кремния или квантовые точки). Есть красители для ядер, связывающиеся с ДНК, – DAPI и Hoechst 33342. Правда, они светят в коротковолновом ультрафиолетовом диапазоне, что снижает возможности их детекции. Очень распространены красители разного спектра, связывающиеся с липидами клеточных мембран или внеклеточными везикулами, например красители семейства РКН – метки с яркой флуоресценцией. Они были названы в честь своего первооткрывателя (Paul Karl Horan) и представляют собой липофильные производные карбоцианинов. Они проникают в мембраны клеток и не влияют на их функциональную активность. Такие метки могут долго сохраняться, обеспечивая возможность наблюдения за введёнными клетками в течение нескольких недель. Есть специальные красители для определённых органелл в клетках, например митохондрий (они называются митотрекеры) и лизосом (лизотрекеры). Иногда используют цитоплазматические красители, например кальцеин, 5(6)-карбоксифлюоресцеиндиацетат (CFDA) или эфир карбоксифлюоресцеина (CFSE), которые после проникновения в клетку так меняют свою структуру, что уже не могут выйти. К сожалению, со временем они так или иначе выводятся из клетки, что приводит к снижению яркости сигнала, кроме того, краситель может попасть в окружающие клетки, что приведёт к искажению результатов.
Широко используются генетические метки: перед введением клетки подвергаются генетической модификации специальными конструкциями, кодирующими флуоресцентный или биолюминесцентный белок. Примером первого может быть зелёный флюоресцентный протеин (GFP), а второго – люцифераза светлячков. В результате, попадая в нужное место, клетки начинают в прямом смысле светиться, и исследователи это видят. При этом второй тип белков иногда предпочтительнее, так как фермент люцифераза обладает высокой специфичностью, поэтому в живых тканях не возникает фона (при использовании флуоресцентного белка он может быть существенным и мешать наблюдениям).
Для визуализации биолюминесцентных и флуоресцентных меток учёные используют системы оптической визуализации для неинвазивных прижизненных наблюдений за экспериментальными животными, например IVIS® Spectrum, Kodak или Newton. Они преобразуют биолюминесцентные или флуоресцентные сигналы в объёмную картинку, накладываемую на трёхмерную топографическую модель объекта: целого животного или отдельного органа. Для этого животных на короткое время усыпляют и помещают в тёмную комнату, которая оснащена высокочувствительной камерой для съёмки. Условия подопытных тоже комфортные: в помещении есть подогреваемый столик, порты для дыхания, система очистки от отходов. Набор световых фильтров и алгоритмов спектрального несмешивания позволяет использовать биолюминесцентные и флуоресцентные метки в разных диапазонах волн и даже разделить сигналы от нескольких флуоресцентных меток в одном и том же животном. Кроме того, полученные результаты можно соотнести с данными других методов визуализации, о которых мы поговорим ниже: магнитно-резонансной томографии (МРТ), компьютерной томографии (КТ) или позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) в режиме мультимодальности.
Флуоресцентная визуализация тканей, отдельных клеток и субклеточных частиц
Неоптические способы заглянуть внутрь живого организма
Среди неоптических методов чаще всего применяются МРТ и радионуклидные методы. Они позволяют глубже заглядывать в ткани и дают представление как о структурной организации объекта, вплоть до молекулярного уровня, так и о функциональной составляющей – например, о способности клеток потреблять глюкозу, окислительно-восстановительном балансе или даже степени дифференцировки клеток. Их мощное преимущество – возможность использовать такие подходы не только у животных, но и у человека. В них используют различные контрасты для повышения чёткости изображения клеток, например суперпарамагнитные частицы оксида железа (SPIOs), очень хорошо совместимые с клетками и позволяющие «увидеть» даже небольшую группу клеток, соединения на основе гадолиния и другие современные парамагнитные агенты. Как и в случае с флуоресцентными метками, агенты или наночастицы для контрастирования можно заранее вводить в исследуемые клетки разными способами или проводить генетическую модификацию клеток, чтобы они, например, лучше накапливали железо (или какой-то другой элемент).
Для радионуклидного имиджинга в клетки вводят радиоактивно-меченые биологически активные соединения, которые потом фиксируются специальными приборами. Это позволяет отслеживать распределение введённых клеток в организме, следить за их миграцией и даже определять биологически активные соединения в клетках и межклеточном пространстве. Для этой цели используют гамма-излучающие радиоизотопы (например, технеций-99м, индий-111, йод-123, йод-131) и отслеживают их накопление с помощью однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (КТ) или позитрон-излучающие радиоизотопы (кислород-15, углерод-11, азот-13, фтор-18), которые детектируют с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ). Эти методы обладают высочайшей чувствительностью, поэтому можно вводить совсем небольшие количества радиоактивно-меченых соединений с относительно небольшой дозой радиации. Тем не менее, конечно, использование радионуклидных меток несёт в себе риски радиационной нагрузки как на объект исследования, так и на самого исследователя, поэтому такие эксперименты проводятся в очень ограниченном числе лабораторий, где есть система защиты от радиоактивного облучения.
Можно также комбинировать методы визуализации, основанные на разных физических принципах, используя мультимодальный имиджинг, что позволяет наблюдать за судьбой введённых клеток и связанных с ними изменениях в тканях на разных уровнях, а также подбирать оптимальное сочетание чувствительности, специфичности, разрешения и глубины изучения. Например, радиоизотопы можно заключать в наночастицы из разных полимеров или квантовые точки, которые тоже могут «светиться». Это приводит к уменьшению облучающего воздействия радиоактивной метки и увеличению срока наблюдения, а для детекции можно совмещать преимущества разных способов: высокую чувствительность ПЭТ с хорошим пространственным разрешением МРТ или флуоресцентную визуализацию.
В настоящее время системы прижизненной визуализации продолжают активно совершенствоваться: разрабатываются новые метки и способы внедрения их в клетку, более чувствительные методы детекции и многофункциональные приборы для того, чтобы следить за введёнными клетками в организме экспериментальных животных и даже человека.
Иллюстрации: анонс – Елена Рюмина, статья – предоставлены Анастасией Ефименко
