Современным учёным повезло, потому что в течение прошлого и нынешнего веков были разработаны и внедрены в практику множество полезных методов, позволяющих аккуратно выделять из тканей и длительно поддерживать вне организма жизнедеятельность самых разных типов клеток. Для работы с клетками «в культуре» (то есть «в пробирке» в лаборатории) нужны специализированные условия. Конечно, они создаются искусственно, но основаны на понимании естественного микроокружения клеток в тканях и органах. Подавляющее большинство клеток в сложноустроенном многоклеточном организме связано друг с другом межклеточными контактами и с внеклеточным матриксом с помощью специальных белков, и если эти связи разрушить, то клетки гибнут. Но для того, чтобы выделить клетки в культуру, чаще всего именно это и нужно сделать (обычно с помощью ферментов и механической обработки), чтобы высвободить их. А для восстановления таких контактов в лабораторных условиях используют широкий спектр культуральных пластиковых ёмкостей – чашки Петри и флаконы, планшеты с лунками разных размеров, и выделенные клетки прикрепляются к их поверхности (этот процесс называется адгезия клеток). Сейчас коммерческие компании предоставляют огромное разнообразие культуральной посуды для удобства экспериментов с клетками. Такие ёмкости можно покрывать разными синтетическими или биологическими покрытиями, повышая вероятность выживания «капризных» клеточных культур, стимулируя или снижая адгезию клеток, изменяя их свойства, позволяя выживать преимущественно нужным для учёного клеточным субпопуляциям. Исключение составляют клетки крови и других биологических жидкостей, а также некоторые клеточные линии, частично похожие на опухолевые клетки – их чаще культивируют в суспензии, то есть без прикрепления к подложкам. Ещё один вариант выделения клеток – использование эксплантной культуры, когда выделенные ткани не разрушают, а маленькими кусочками выкладывают в культуральную посуду и ждут, когда из них выползут нужные клетки на поверхность пластика.
Что ещё нужно клеткам в культуре? Конечно, питание. Разработка и создание питательных сред для клеточных культур – это важнейшая задача, которой сегодня занимаются многие исследователи и коммерческие компании. В идеале для каждого клеточного типа должен быть подобран свой состав культуральной среды – это обычно буферный раствор, способный поддерживать нейтральный рН, низкомолекулярные компоненты (витамины, аминокислоты и т. п.) и – самое критичное – питательные добавки, в каком-то смысле имитирующие кровь, которая в организме питает клетки. Для многих культур клеток в качестве питательной добавки используют сыворотку из крови крупного скота, конечно, определённым образом подготовленную и протестированную на наличие инфекционных агентов. Можно использовать и компоненты крови человека: например, лизат тромбоцитов или собственную сыворотку крови того донора, из тканей которого выделены клетки – так ещё лучше получается имитировать нативные условия и сохранить свойства клеток. Поскольку состав сыворотки крайне сложно контролировать точно (в ней сотни компонентов в разных концентрациях), то для тонких экспериментов с клетками можно использовать бессывороточные среды, в которые добавлен строго дозированный по количеству коктейль питательных и регуляторных факторов. Для рутинной работы с клеточными культурами подбирают такие питательные добавки, чтобы клетки в ответ на них делились, соответственно, их количество увеличивалось и можно было ставить разные эксперименты с одной и той же культурой. Но для более сложных экспериментов, когда нужно, например, оценить влияние какого-то одного фактора на функцию клеток, могут, напротив, временно убирать питательные добавки, чтобы стандартизировать условия эксперимента и заставить «поголодавшие» клетки лучше отвечать на изучаемый стимул.
Для поддержания привычной температуры (для большинства культур это 37С, хотя для некоторых, например, клеток из семенников, может быть и ниже – 35С), влажности и определённого газового состава атмосферы культуральные ёмкости с клетками в питательной среде помещают в специальные инкубаторы. Современные приборы позволяют варьировать, например, уровень кислорода, подбирать его под тип клеток – ведь в организме большинство из них существует при уровне кислорода гораздо ниже, чем в атмосфере. А ещё можно искусственно сильно снизить содержание О2и таким образом смоделировать гипоксию, чтобы оценить, как клетки будут с ней справляться. Это позволяет лучше понять механизмы клеточных ответов на гипоксию тканей при широко распространенных ишемических заболеваниях. Если нужно нарастить много-много клеток, допустим, для клеточной терапии или для производства с помощью клеток биотехнологических препаратов или вакцин, то используют не инкубаторы, а большие биореакторы ёмкостью вплоть до многих сотен литров, внутри которых клетки в суспензии или прикрепленные к микроносителям в питательной среде перемешиваются для лучшей аэрации, делятся и могут быть получены в огромном количестве.
Наконец, при работе с клетками нужно помнить, что такие прекрасные культуральные условия и вкусные питательные среды очень нравятся и микроорганизмам. Контаминация (заражение) клеточных культур, например, бактериями или грибами – это то, с чем необходимо тщательно бороться. Для этого с клетками работают в суперчистых культуральных боксах, в перчатках и отдельной лабораторной одежде, используют стерильную одноразовую посуду и стерильные расходные материалы, обрабатывают руки и поверхности антисептиком, а в питательные среды добавляют при необходимости антибиотики и антимикотики. Микробиологическую чистоту клеточных культур постоянно проверяют, а если обнаруживают контаминацию, клетки утилизируют, как бы их ни было жалко. Если только заражение определёнными вирусами или микроорганизмами клеток не входит в задачи исследователя (а это часто используется для направленного изменения свойств клеток, например, для редактирования их генома), конечно, но тогда эти эксперименты выполняются в отдельных условиях.
Некоторые клеточные культуры легко культивировать, их можно многократно пересаживать на новые ёмкости и снова наращивать для работы – особенно это касается так называемых перевиваемых клеточных линий, часто похожих на некоторые опухолевые клетки. Но есть и сложные клеточные культуры, которые очень требовательны к культуральным условиям.
К последним относятся различные типы стволовых клеток, а как раз с ними часто работают исследователи, занимающиеся проблемами регенеративной медицины, ведь именно стволовые клетки отвечают за регенерацию – полноценное обновление и восстановление тканей. В организме они правильно функционируют только в очень сложно устроенном микроокружении – нише стволовой клетки, и воспроизвести такие условия invitroдаже частично – задача непростая. Для этого исследователи подбирают разные комбинации подложек и специфических питательных добавок, вносят в культуру другие «поддерживающие» клетки (например, стромальные), имитируют регуляторные сигналы, управляющие функциями стволовых клеток. Это очень увлекательная и необходимая область регенеративной медицины, позволяющая разобраться в ключевых механизмах работы стволовых клеток, которые позволяют им превращаться в нужные типы клеток и восстанавливать утраченные, например, при повреждении ткани и органы.
И, конечно, нельзя забывать, что в норме клетки существуют в трёхмерном пространстве, и его воспроизведение в культуре может помочь лучше сохранить «нативное» состояние выделенных клеток. Поэтому сейчас очень много усилий направлено на переход от 2Dкультивирования клеток к 3Dмоделям, когда клетки растут вне организма в составе многоклеточных трехмерных конструкций – сфероидов, клеточных пластов, внутри подобранных гидрогелей, органоидов, участвуя в самоорганизации таких структур. Такие модели лучше имитируют существование клеток в тканях и позволяют воспроизводить огромное разнообразие нормальных и патологических условий для изучения поведения и функций клеток «в пробирке» с дальнейшей аппроксимацией этих результатов уже на эксперименты invivo.
Достижения в области культивирования клеток сделали возможным создание в лабораторных условиях тканей, органов и даже целых организмов из одной клетки, и даже не обязательно половой, а вообще из любой. Благодаря этому совершенно новый вектор развития приобрели исследования механизмов физиологического обновления тканей и патогенеза заболеваний человека на клеточном уровне, возникли и стали активно развиваться такие перспективные направления, как регенеративная медицина, клеточная терапия и редактирование генома. Всё более доступными становятся как возможности полноценного анализа одиночных клеток, так и разнообразные омиксные технологии и подходы тканевой инженерии – создания аналогов тканей и органов из клеток на специальных каркасах. Все эти достижения служат научной основой регенеративной и персонифицированной медицины.
Иллюстрация: Елена Рюмина
